Eftir 25 daga kyrrstæða ræktun við 28°C sýndi lakkasi úr *Pleurotus ostreatus* NRC620 mesta virkni í svepparæktunarmiðlinum. Kjörgildi fyrir pH og hitastig fyrir þetta ensím voru 3,0 og 70°C, talið í sömu röð. Eftir 2 klukkustunda ræktun við 40°C og 50°C var ensímvirknin 68,33% og 59,61%, talið í sömu röð. Eftir 2 klukkustunda ræktun í sítrat-fosfat stuðpúða (pH 7,0) var ensímvirknin 100%. Viðbót 10 mM MgSO₄ og CuSO₄ jók ensímvirknina um það bil 21% og 35%, talið í sömu röð, en NaCl, MnCl₂, KCl og CaCl₂ hamluðu ensímvirkninni. Með því að nota ABTS sem hvarfefni voru hvarfhraðabreyturnar (Km og Vmax) fyrir *Pleurotus ostreatus* NRC 620 lakkasa 1,99 mM og 16.217 μmol mín−1 L−1, talið í sömu röð. Ensímmeðferð á eplasafasýnum lækkaði bæði pH og seigju verulega og þessi lækkun tengdist aukinni geymslutíma. Lakkasameðferð leiddi til lítilsháttar lækkunar á heildarfenólinnihaldi eplasafa, en engin lækkun á andoxunarvirkni sást.
Á undanförnum árum hafa vísindamenn einbeitt sér að notkun grænnar líftækni í matvælaiðnaði. Lakkasa er eitt gagnlegasta ensímið í matvælaiðnaðinum og hefur fundið notkun á sviðum eins og safavinnslu, bakstri, vínstöðugleika og að bæta skynræna eiginleika matvæla.1Margar háplöntur og örverur seyta lakkasa,2og sveppir eins og deuteromycetes, ascomycetes og basidiomycetes geta einnig framleitt lakkasa.3Lakkasi (EC 1.10.3.2) er blár oxídasi sem afoxar súrefni í vatn með því að nota kerfi sem samanstendur af þremur mismunandi koparatómum og oxar þannig ýmis fenólsambönd og arómatísk amín. Við framleiðslu ávaxta- og grænmetissafa eru ensímbundin og óensímbundin brúnun mikilvæg atriði.4Þar sem þessi efni hafa neikvæð áhrif á lit, bragð og ilm safans verður að fjarlægja þau.5
Af öllum ávöxtum eru epli mest neyttur um allan heim og í Evrópusambandinu. Árið 2019 var eplaframleiðslan í þriðja sæti á heimsvísu, yfir 87 milljónir tonna.6Epli innihalda fjölmörg fenólsambönd, þar á meðal flavonoid og fenólsýrur eins og koffínsýru og klórógensýru.7Þar sem eplasafi er yfirleitt neytt í tæru formi tapast um það bil 50% til 90% af fenólískum efnisþáttum við síun.8Í dag velja neytendur gjarnan vörur sem eru lítið unnar, eins og skýjaðan eplasafa með hátt pólýfenólinnihald. Hins vegar, vegna mikils fenólinnihalds, er þessi tegund af eplasafa sérstaklega viðkvæm fyrir mislitun og dökknun.9Ýmsar aðferðir, þar á meðal hitameðferðaraðferðir eins og gerilsneyðing við 60–90°C, eru notaðar til að draga úr eða koma í veg fyrir dökknun eplasafa.10Hins vegar samkvæmt rannsókn Sauceda-Gálvez11, hitameðhöndlun getur eyðilagt rokgjörn efni og haft áhrif á skynræna eiginleika eplasafa. Aðferðir sem hægt er að nota í stað hitameðhöndlunar eru meðal annars ofurkritískt koltvísýringur, útfjólublá geislun, ómskoðun, hár vatnsstöðuþrýstingur eða háþrýstingsmeðhöndlun.12Skilvirkni þessara tækni og afrakstur hentugra ávaxtasafa fer eftir þeim breytum sem notaðar eru og eiginleikum vörunnar. Víðtæk notkun þeirra er takmörkuð af miklum kostnaði, skaðlegum áhrifum á gæði sumra matvæla eða ófullnægjandi ensímaóvirkjun.13,14
Lakkasa má nota til að stöðuga og skýra ávaxtasafa.15Gökmen o.fl.16Ég mæli með notkun lakkasa til að hreinsa ávaxtasafa því það fjarlægir á áhrifaríkan hátt fenólsambönd með því að breyta þeim í fjölliður eða fáliður sem auðvelt er að fjarlægja með hvaða örsíun sem er, sem gerir eplasafa kleift að viðhalda stöðugum lit og tærleika í allt að sex vikur við 50°C. Hreinsað *Trichoderma* lakkasa var fest á áloxíðperlum og notað til að fjarlægja sértækt bragðefnasambönd af völdum örverumengun í eplasafa.17
Um það bil 80-90% af rokgjörnum efnunum í eplasafa eru esterar og aldehýð, sem gefa safanum einstakt ilmefni.18Lakkasa úr *Trametes versicolor* var fest á ódýrt undirlag úr náttúrulegum trefjum úr ungum kókosskeljum til að hreinsa eplasafa.19Fyrri rannsóknir hafa kannað stöðugleika eplasafa (lit og grugg) með því að nota ensímlausar aðferðir eða aðferðir til að festa efnið í vökvakerfinu, eða í samsetningu við öfgasíun.5,19Hins vegar eru áhrif sveppalakkasa á efnafræðilega eiginleika eplasafa við geymslu enn óljós. Þess vegna var markmið þessarar rannsóknar að kanna með tilraunum breytingar á efnafræðilegum eiginleikum, fenólinnihaldi og andoxunarvirkni eplasafa eftir meðhöndlun með sveppalakkasa og tveggja vikna kæligeymslu. Lakkasa hafa getu til að oxa fenólsambönd, sem gerir þau efnileg til notkunar í ýmsum iðnaðarferlum, þar á meðal hreinsun safa. Þessi rannsókn skoðaði lakkasa úr *Pleurotus ostreatus* NRC 620, með áherslu á kjörskilyrði fyrir virkni þeirra og árangur við hreinsun safa. Þó að rannsóknir á ostrusveppum (P. ostreatus NRC 620) séu enn takmarkaðar, hafa fyrri rannsóknir skoðað ensím úr ýmsum sveppauppsprettum, svo sem Trametes versicolor og Ganoderma lucidum. Markmið þessarar rannsóknar var að meta möguleika á notkun þessa ensíms í matvælaiðnaði og varpa ljósi á einstaka eiginleika þess, sérstaklega kjörsýrustig og hitastig.
2,2′-asóoxýbis(3-etýlbensótíasólín-6-súlfónsýra) (ABTS) var keypt frá Sigma-Aldrich (Kanada). Öll önnur hvarfefni voru af greiningargráðu.
Örveruræktarmiðstöð Þjóðarrannsóknarmiðstöðvarinnar fékk þekkta ostrusveppastofninn NRC620. Eftir undirræktun var stofninn geymdur á kartöfludextrósaagarskáum við 4°C. Undirbúningsaðferðin fyrir ígræðsluna var sem hér segir: 10 daga gamalt, fullþroskað sveppaþráður var sáð á kartöfludextrósaagarplötur og ræktaður við 28°C. Eftir 10 daga voru þrír 12 mm þvermál sveppaþráðablokkir fjarlægðir úr agarmiðlinum með dauðhreinsuðum málmpínu og settir í 250 ml Erlenmeyer-flöskur með bómullartappa sem innihéldu 50 ml af dauðhreinsuðum ræktunarmiðli (pH 5,0, eins og áður hefur verið lýst af Othman o.fl.20Ræktunum var haldið við 28°C í 18 daga. Ræktunum var síðan síað í gegnum Whatman nr. 1 síupappír og ofanfljótandi vökvinn sem ensímgjafi var notaður.
Lakkasavirkni var ákvörðuð með því að nota ABTS sem hvarfefni. Hvarfblandan (2 ml) innihélt 500 μL af 0,3 mM ABTS (uppleyst í 0,1 M natríumsítratlausn, pH 4,5) og nauðsynlegt magn af ensímsýni þynnt með eimuðu vatni.21,22Þar sem lakkasi getur oxað ABTS við stofuhita (28 °C ± 2), var ABTS oxun ákvörðuð með því að mæla aukningu í gleypni við 420 nm (ε420= 36.000 cm-1 M -1) með því að nota Agilent Carry-100 útfjólubláa litrófsmæli. Ein eining af lakkasavirkni þurfti til að oxa 1 μmól af ABTS á mínútu. Próteinþéttni var ákvörðuð með Bradford aðferðinni með því að nota nautgripasermisalbúmín sem innri samanburð.23,24
Eftir að ensímið var fengið úr ostrusveppastofninum NRC 620 var virkni þess mæld á mismunandi ræktunartímabilum í 25 daga við kyrrstæðar aðstæður við 28°C.
Til að rannsaka áhrif hitastigs á lakkasavirkni voru tilraunir gerðar á hitastigsbilinu 20 til 90°C. Áður en ensíminu var bætt við og viðbrögðin hafin voru stuðpúðinn (0,1 M natríumsítrat, pH 4,5) og hvarfefni (ABTS) blandað saman og ræktuð í 5 mínútur við mismunandi hitastig. Hitastöðugleiki ensímsins var metinn með því að rækta í 0,05 M natríumfosfatstuðpúða (pH 7,0) við 40, 50, 60 og 70°C í 2 klukkustundir, talið í sömu röð. Leifarvirkni var síðan metin með því að nota ABTS hvarfefnið.
Áhrif sýrustigs á lakkasavirkni voru metin með því að nota ABTS sem hvarfefni í 0,1 M sítrat-fosfat stuðpúðum með sýrustig á bilinu 2,5 til 7,0. Ensímlausnin var ræktuð við 40°C í tvær klukkustundir í 0,1 M sítrat og Tris stuðpúðum (sýrustig 3, 4, 6 og 7) til að meta sýrustigsstöðugleika. Leifarvirkni með ABTS sem hvarfefni var reiknuð eftir ræktun.
Lakkasa var ræktað í 10 mínútur í natríumfosfatlausn (0,05 M, pH 7,0) sem innihélt ýmsar málmjónir (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+ og Mn2+) í styrk 2,5 mM og 10 mM, talið í sömu röð. Undirlagið (ABTS) var síðan bætt við til að hefja viðbrögðin og hlutfallsleg virkni var metin.
Oxun ABTS með lakkasa við mismunandi styrk (0,025–3 mM) var mæld við pH 4,5 til að ákvarða hvarfhraðabreyturnar (Vmax og Km).fastarMichaelis-Menten jöfnunnar voru reiknaðar með Lineweaver-Burk grafi, sem teiknar gagnkvæma tölu hvarfhraðans sem fall af hvarfefnisþéttni. Hreyfihraðastuðlarnir voru reiknaðir út frá Lineweaver-Burk grafinu með því að nota GraphPad Prism útgáfu 6.01 hugbúnað.
Eftir að eplin höfðu verið þvegin vandlega með kranavatni voru þau skorin í tvennt og safinn pressaður úr þeim með sjálfvirkri Braun MP80 eplapressu (framleiddri í Þýskalandi). Safinn var síaður í gegnum fjögur lög af ostaklút. Engin ensím voru bætt við samanburðarhópinn, en 2,0% lakkasi (virkasta styrkurinn sem prófaður var) var bætt við nýlagaðan eplasafa, sem síðan var geymdur við 4°C í tvær vikur.
Títranlegt sýrustig (TA) og pH voru ákvörðuð samkvæmt aðferð Boulton o.fl.al.27. Sýrustig hvers sýnis var mælt með stafrænum sýrustigsmæli (JENWAY 3510 sýrustigsmælir). Títranlegt sýrustig (TA) var reiknað út frá eplasýru með eftirfarandi formúlu.
Þar sem V og C eru rúmmál (ml) og styrkur (0,1 mól/l) natríumhýdroxíðlausnarinnar sem notuð var við títrunina, talið í sömu röð. K er umbreytingarstuðull eplasýru, jafnt og 0,067, og W er massi (g) eplasafa.
Heildaruppleysanlegt fast efni (TDS) innihald allra safasýna var ákvarðað með PAL-1 vasabrotsmæli (ATAGO, Tókýó, Japan). Eftir hverja mælingu var ljósleiðaralinsan skoluð með afjónuðu vatni og hvert eplasafasýni prófað þrisvar sinnum. Gildi hvers sýnis var reiknað með því að taka meðaltal af þremur mælingum. Meðaltal ± staðalfrávik fyrir hvert eplasafasýni var einnig reiknað með því að taka meðaltal af þessum niðurstöðum.
Seigjuteygjanleiki eplasafasýnanna var metinn með snúningsseigjumæli (RV, Rheotest 2, Þýskalandi). Sýnið var sett inni í „S2“ sívalningi seigjumælisins. Sýnileg seigja var táknuð með hallatölu klippispennuferilsins á móti klippihraða, sem var reiknuð út frá klippispennunni og samsvarandi ferlum við mismunandi klippihraða (frá 1,00 til 437,4 s⁻¹). Formúlan til að reikna út sýnilega seigju er sem hér segir:
Þar sem η er sýnileg seigja (cP), τ er klippspenna (dyn/cm²), γ er klippihraðinn (sec⁻¹) og (τ) er reiknað út frá togkrafti (α) og strokkgildum (Z) með eftirfarandi formúlu: τ = Z . α.
Brúnunarvísitalan var ákvörðuð samkvæmt aðferð Meidav etc.al.2910 ml af safasýni var skilvindt við 2750 xg í 10 mínútur. 5 ml af safayfirborðinu voru blandaðir saman við 5 ml af 95% etanóli. Gleypni blöndunnar var mæld við 420 nm með Shimadzu UV litrófsmæli (UV-1601 PC).
Heildarfenólinnihald (TPC) var ákvarðað litrófsmælanlega með því að nota Folin-Ciocalteu hvarfefnið eins og lýst er af Boulton o.fl.[27]Staðlað ferli fyrir gallínsýru var smíðað fyrir styrk frá 0 til 500 mg/L (r²= 0,997). Niðurstöður eru gefnar upp sem gallínsýrujafngildi (mg GAE/ml).
Bætið 125 μL af eimuðu vatni og 2850 μL af FRAP-lausn út í 25 μL af eplasafa og látið blönduna standa í myrkri í30mín. Mældu síðan gleypnina við 593 nm með Shimadzu UV litrófsmæli (UV-1601 PC). FRAP hvarfefnið var útbúið með því að blanda saman 300 mM asetatlausn (pH 3,6), 20 mM járn(III) klóríði og 10 mM 2,4,6-tris(2-pýridýl)tríazíni (TPTZ) (uppleyst í 40 mM HCl) í hlutfallinu 10:1:1. Staðalkúrfa var búin til með Trolox sem staðli (R²= 0,999) og niðurstöðurnar eru gefnar upp sem μM Trolox/mL.
Andoxunarvirkni meðhöndluðu og ómeðhöndluðu safans var ákvörðuð með DPPH aðferðinni til að meta getu þeirra til að binda DPPH sindurefni.31Tíu míkrólítrar af safa voru blandaðir saman við 1 ml af DPPH lausn (100 μM) í metanóli. Eftir viðbrögð í myrkri í 30 mínútur var gleypni blöndunnar mæld við 517 nm með Shimadzu UV litrófsmæli (UV-1601 PC). Niðurstöðurnar voru gefnar upp sem trolox jafngildi (μM trolox/ml) byggt á kvörðunarferli (R2= 0,990).
Gögnin sem fengust sýndu að hámarksframleiðsla lakkasa sást í NRC 620 ostrusveppum í lok 18. dags gerjunar og náði virkni upp á 1302 U/L. Þetta þjónaði sem grundvöllur fyrir því að ákvarða kjörræktunartíma fyrir lakkasaframleiðslu (Mynd 1). Þó að ensímframleiðsla jókst með auknum ræktunartíma var aukningin ekki í beinu hlutfalli við ræktunartímann; eftir 21 dag hafði ensímvirkni aðeins aukist um 90 U/L (í 1390 U/L). Því voru 18 dagar að lokum valdir sem kjörræktunartími til að vega og meta uppskeru afurðarinnar á móti efnahagslegum ávinningi af lengri ræktunartíma.
Áhrif ræktunartíma á lakkasauppskeru í Pleurotus ostreatus NRC 620. Þrjár (12 mm) sveppaþráðablokkir voru sáðar í 50 ml af dauðhreinsuðu ræktunarvökva og síðan ræktaðar við 28°C í mismunandi tíma.
Í samræmi við aðrar rannsóknir benda niðurstöður okkar til þess að kjörræktunartímabilið til að ná hámarks seytingu lakkasa af völdum sveppa sé líklega á milli 7 og 36 daga.32Samkvæmt Ezike o.fl.33, *Trametes polyzona* WRF03 framleiddi mest magn af lakkasa í lok níunda dags gerjunar, með sértæka virkni upp á 1637 U/mg prótein. Ennfremur, Othman o.fl.34kom í ljós að *Trichoderma harzianum* S7113 seytti miklu magni af lakkasa á fimmta degi ræktunar. Lakkasaframleiðslan náði hámarki á fjórtánda degi og minnkaði síðan smám saman.34Þó að ensímseyting geti einnig átt sér stað á aðalvaxtarfasa, þá nær hún venjulega hámarki á millifasa og er hrundið af stað með neyslu kolefnis- eða köfnunarefnisgjafa.34,35
Þótt lakkasi úr Pleurotus ostreatus NRC 620 hafi sýnt mikla virkni yfir breitt hitastigsbil frá 50°C til 80°C, og náði hámarksvirkni (69–98%), sást hámarksvirkni þess við 70°C (Mynd 2a). Utan þessa hitastigsbils minnkaði ensímvirkni við um það bil 70°C. Þessar niðurstöður benda til þess að ensímið sé virkt við hátt hitastig, líklega vegna þess að hátt hitastig eykur hreyfiorku hvarfsins.
Áhrif hvarfhitastigs (a) og sýrustigs (pH) á lakkasavirkni í *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Hitastig á bilinu 20 til 90°C var náð með því að forrækta blönduna við mismunandi hitastig í 5 mínútur áður en ensíminu var bætt við og hvarfið hófst. Áhrif sýrustigs á lakkasavirkni voru metin með því að nota ABTS sem hvarfefni í lausnum sem innihéldu 0,1 M sítrat-fosfat stuðpúða yfir sýrustigsbilið 2,5 til 7,0.
Samkvæmt Ezike o.fl.al.33, kjörhitastig fyrir *Trametes polyzona* WRF03 lakkasa er 55°C, sem er það sama og fyrir *Ganoderma lucidum*laccase36og svipað og kjörhitastigið (50°C) fyrir *Trametes polyzona* KU-RNW02737lakkasi . Baldrian38bendir á að, eins og fyrir önnur lignín-niðurbrjótandi ensímkerfi, er kjörhitastigið fyrir lakkasa á milli 50 og 70°C.
Niðurstöðurnar sýndu að ensímið sýndi mesta virkni við pH 3,0 og náði 94% virkni við pH 3,5. Það var þó virkt á breiðu pH-bili frá 2,5 til 7,0 (Mynd 2b). Ennfremur sýndi það meiri virkni við súr skilyrði samanborið við hlutlaus eða basísk skilyrði. Virkni þess hélst að minnsta kosti 77% á pH-bilinu frá 2,5 til 4,5, en náði aðeins um það bil 38% við pH 7,0. Kjörpasta pH-gildi fyrir lakkasa úr *Trametes polyzona* WRF03 var 4,533, sem er það sama og pH-gildi fyrir lakkasa úr *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40 og *Trametes hirsuta* 41. Hins vegar, samkvæmt rannsókn Chairin o.fl.42, besta pH gildið fyrir lakkasa úr *Polymorpha f. sp.* WR710-1 er 2,2, en besta pH gildið fyrir lakkasa úr *Polymorpha f. sp.* IBL-04 er 5,043. Binding hýdroxíðjóna (lakkasahemill) við koparatóm T2/T3 lakkasa gæti verið ástæðan fyrir minnkaðri lakkasavirkni við hlutlaus eða basísk pH skilyrði. Þetta getur truflað innri rafeindaflutning frá T1 miðjunni til T2/T3 miðjunnar, og þar meðtakmarkandiensímvirknin23,44
Með því að rækta ensímið við mismunandi hitastig kom í ljós að bæði ræktunartími og hitastig höfðu áhrif á stöðugleika ensímsins. Athyglisvert er að lakkasi úr *Trametes polyzona* NRC 620 sýndi meiri stöðugleika við 40℃ og 50℃ og hélt 68,33% og 59,61% af upphaflegri virkni sinni, talið í sömu röð, eftir 120 mínútur (Mynd 3a). Aftur á móti, við sömu aðstæður (40℃ og 50℃, 120 mínútur), hélt lakkasi úr *Trametes polyzona* WRF03 64,38% og 42,92% af virkni sinni, talið í sömu röð.33Þvert á móti minnkaði aukinn ræktunartími og hitastig stöðugleika lakkasa af gerðinni *Trametes polyzona* NRC 620; eftir ræktun við 60°C og 70°C í 60 mínútur minnkaði virkni þess í 39,24% og 1,72%, talið í sömu röð (Mynd 3a). Í samræmi við tilraunaniðurstöður sýndi lakkasi úr *Trametes polyzona* WRF03 meiri stöðugleika við 40 og 50°C í gegnum allan hitameðferðarferlið.33Á sama hátt, Lueangjaroenkit o.fl.al.37og formaður o.fl.al.42greindi frá stöðugleika lakkasa úr Trametes polyzona KURNW027 og Trametes polyzona WR710-1 við 50°C í 1 klukkustund, talið í sömu röð. Sem gagnlegur lífhvati sem hægt er að nota á ýmsum sviðum líftækni ætti lakkasi að hafa góðan stöðugleika og virkni yfir breitt hitastigsbil.
Hitastöðugleiki (a) og pH-stöðugleiki (b) lakkasa úr *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Hitastöðugleiki var metinn með því að rækta ensímlausnina í 0,05 M natríumfosfatlausn (pH 7,0) við 40, 50, 60 og 70°C í 2 klst., talið í sömu röð. pH-stöðugleiki var metinn með því að rækta ensímlausnina í 0,1 M sítratlausn og Tris-lausn (pH 3, 4, 6 og 7) við 40°C í 2 klst. Leifarvirkni var reiknuð með því að nota ABTS sem hvarfefni eftir ræktun.
Til að ákvarða bestu skilyrðin fyrir notkun og geymslu ensíma rannsökuðum við áhrif sýrustigs (pH) á stöðugleika lakkasa. Útsetning fyrir mismunandi pH-gildum hafði marktæk áhrif á stöðugleika próteinbyggingarinnar og þar með á stöðugleika og virkni ensímsameindarinnar. Niðurstöðurnar sýndu að ensímið var minna stöðugt við súr skilyrði, en það sýndi betri stöðugleika við hærri pH-gildi (hlutlaus og basísk svæði). Við pH-gildi 7,0, 6,0, 4,0 og 3,0 var varðveisluhraði ensímsins eftir 120 mínútur um það bil 100%, 62,54%, 52,39% og 11,14%, í sömu röð (Mynd 3b). *Strombus multisus* WRF03 lakkasi sýndi meiri stöðugleika við hlutlaus pH-gildi (5,5–6,5) og minni stöðugleika við súr pH-gildi (undir 4,0). Eftir 120 mínútur við pH gildi 5,5, 6,0 og 6,5 voru ensímgeymsluhlutföll um það bil 82%, 100% og 93%, talið í sömu röð.33Khairin o.fl.42tóku fram að lakkasi úr Trametes polyzona WR710-1 var stöðugur á pH-bilinu 6,0 til 7,0, en Sayed o.fl.45sýndi að lakkasi var stöðugra við hlutlaus pH-skilyrði. Hins vegar sýndi lakkasi úr Cerrena unicolor einnig stöðugleika við basískar aðstæður (pH 9,0).46Lakkasarnir sem rannsakaðir voru sýndu mikla stöðugleika yfir breitt pH-bil. Þetta gæti verið mikilvægur eiginleiki fyrir iðnaðarnotkun.
Þar sem sumar málmjónir hafa bæði örvandi og hamlandi áhrif á ensímvirkni, verður að hafa áhrif þeirra á ensímvirkni í huga í iðnaðarnotkun. Þetta er mikilvægt þar sem málmjónir eru algeng umhverfismengunarefni sem geta haft áhrif á stöðugleika og myndun utanfrumuensíma.47Til að kanna áhrif margra málmjóna á lakkasa úr *Pleurotus ostreatus* NRC 620, framkvæmdum við samsvarandi tilraunir. Eins og sést á mynd 4, eftir því hvaða málmtegund var notuð, hafði aukning á málmjónaþéttni úr 2,5 mM í 10 mM neikvæð áhrif á virkni ensímsins. Til dæmis,Mg²⁺ , Co²⁺ , Zn²⁺ogCu²⁺gæti örvað og virkjað ensímvirkni, á meðanNa⁺ , Mn²⁺ , Ca²⁺ogK⁺gæti hamlað ensímvirkni. Við 10 mM styrk voru Cu²⁺ og Mg²⁺ jónir öflugustu virkjararnir á lakkasavirkni úr *Pleurotus ostreatus* NRC 620, sem veittu um það bil 34% og 20% virkjunarstig, talið í sömu röð. Hins vegar, við 10 mM styrk, voru Ca²⁺ jónir öflugasti hemillinn á lakkasa og drógu úr ensímvirkni um það bil 60%.
Áhrif málmjóna á virkni lakkasa af tegundinni Pleurotus ostreatus NRC 620. Lakkasinn var ræktaður í 10 mínútur í natríumfosfatlausn (0,05 M, pH 7,0) sem innihélt ýmsar málmjónir í styrk 2,5 mM og 10 mM. Viðbrögðin voru síðan hafin með því að bæta við hvarfefninu (ABTS), og að lokum var hlutfallsleg virkni mæld.
Niðurstöður okkar eru í samræmi við niðurstöður annarra höfunda sem komust að því að Mg²⁺ og Cu²⁺ auka virkni *Trametes polyzona* WRF03³. Castaño o.fl.⁴⁸ komust að því að lakkasi úr *Xylaria* sp. er að einhverju leyti örvaður af koparjónum (Cu²⁺). Ennfremur gerðu Foroutanfar o.fl.⁴⁹ og Si o.fl.⁵⁰ svipaðar rannsóknir á lakkasum úr *Paraconiothyrium variabile* og *Trametes pubescens*, talið í sömu röð. Koparbindistaður af gerð II (T2) þessa ensíms getur verið mettaður með Cu²⁺ við tiltekinn styrk, sem gæti skýrt örvun lakkasavirkni við hærri Cu²⁺³⁹ styrk. Þar sem lakkasar í hvítum rotnunarsveppum eru oxídasar sem innihalda mörg koparatóm, eru áhrif koparjóna á lakkasavirkni fjölbreytt og allt frá örvandi og hamlandi til hlutlausra áhrifa.⁵¹ Aftur á móti, Zhou o.fl.[52]greindi frá því aðCu²⁺hamlaði lakkasavirkni neðanjarðartermíta frá Taívan (Odontotermes formosanus). Hins vegar virtust lakkasar af tegundinni Cerena sp. HYB07[53]og Clitocybe maxima[54]voru ekki fyrir áhrifum af koparjónum.
Sértækni hvarfefnisins var táknuð með hvarfhraðabreytum þess (Km og Vmax); því sterkari sem bindingarhæfni hvarfefnisins við ensímið var, því lægra var Km gildið og því hærra var sértækni hvarfefnisins.3,21,55Hreyfifræðilegir breytur (Km og Vmax) lakkasa úr *Pleurotus ostreatus* NRC 620 voru ákvarðaðar með GraphPad Prism 6.0 hugbúnaði með því að teikna Lineweaver-Burk graf (Mynd 5). Þegar ABTS var notað sem hvarfefni voru niðurstöðurnar 1,99 mM og 16217 μmól.mín⁻¹ L⁻¹,hver um sig. Elsayed o.fl.21greint frá því að Km gildi fyrir ABTS oxun væru 0,1 mM og 0,064 mM, talið í sömu röð, sem bendir til mikillar sækni Lac A og Lac B ísóensíma fyrir ABTS. Ennfremur voru Vmax gildin 0,182 μmól.mín⁻¹og 0,603 míkrómólmín⁻¹, hver um sig. Km gildið sem fékkst var lægra en hjá Trametes polyzona WRF03 (8,66 mM); ennfremur var Vmax gildi þeirra (1429 mmól mín⁻¹) einniglægriþegar ABTS er notað sem hvarfefni.33 Á sama hátt voru Km gildi fyrir styrk lakkasa af tegundinni Lentinus squarrosulus MR13 og Trametes sp. AH28-2 0,0714 mM og 0,025 mM, talið í sömu röð, og Vmax gildin voru 0,0091 mM mín−1 og 0,67 mM mín−1 mg−1 (miðað við ABTS), í sömu röð.56,57
Áhrif ABTS-þéttni á virkni lakkasa úr *Pleurotus ostreatus* NRC 620 voru rannsökuð og Lineweaver-Burk graf af gagnkvæmu gildi upphafshraða viðbragða á móti ABTS-þéttni var teiknað. Oxunarviðbrögð ABTS með mismunandi styrk (0,025–3,0 mM) af lakkasa voru mæld við pH 4,5 til að ákvarða hvarfhraðabreyturnar (Vmax og Km). Hreyfihraðastuðlarnir frá Michaelis-Menten voru reiknaðir með Lineweaver-Burk grafi af gagnkvæmu gildi hvarfhraða á móti hvarfefnisþéttni. Hreyfihraðastuðlarnir voru reiknaðir út frá Lineweaver-Burk grafinu með því að nota GraphPad Prism 6.01 hugbúnaðinn.
Hefðbundin skýringarensím, svo sem pektínasar, vatnsrofa pektínefni, sem dregur úr seigju og gruggi. Þau brjóta á áhrifaríkan hátt niður byggingarfjölsykrur og eru oft notuð í samsetningu við önnur ensím, svo sem sellulósa og hemísellulósa, til að bæta uppskeru og tærleika. Hins vegar beinast pektínasar ekki sérstaklega að fenólsamböndum, sem eru helstu þættir gruggs og oxunarbrúnunar, sérstaklega í safa eins og epla- og vínberjasafa.58Aftur á móti hvata lakkasar oxun fenólsambanda með því að fjölliða þau í stærri, óleysanlegar sameindir sem hægt er að fjarlægja með botnfellingu eða síun. Þessi aðferð bætir ekki aðeins tærleika heldur lengir einnig geymsluþol safans með því að draga úr líkum á oxunarbrúnun af völdum fenólsambanda. Ennfremur er hægt að framkvæma lakkasa-byggðar tæringaraðferðir við vægar vinnsluaðstæður (pH 3,5–5,5, hitastig 25–40 °C), sem gerir þær hentugar fyrir viðkvæma safa án þess að skerða næringar- eða skynræna eiginleika þeirra.59Rannsóknir hafa sýnt að pektínasameðferð getur hreinsað safann á 1–2 klukkustundum, en lakkasameðferð krefst yfirleitt lengri viðbragðstíma (3–6 klukkustundir) til að draga alveg úr fenólsamböndum. Hins vegar er hægt að hámarka þetta ferli með því að gera ensímið óvirkt eða með því að sameina lakkasa við vélrænar hreinsunaraðferðir.60Í þessari rannsókn leiddi ensímgreining á hráefnisútdrættinum í ljós verulega lakkasa- og α-amýlasa-virkni, en pektínasa- og xýlanasa-virkni var afar lítil og sellulasa-virkni greindist ekki. Því var minnkun á gruggi og fenólinnihaldi aðallega vegna virkni lakkasa, en breytingin á seigju gæti að hluta til stafað af virkni amýlasa.
Tafla 1 sýnir eðlis- og efnafræðilega þætti nýkreists eplasafa og sýna með lakkasameðferð. Niðurstöðurnar sýndu að uppskera nýkreists eplasafa (71,59%) var lægri en uppskera lakkasameðferðar (87,34%). Þessar niðurstöður eru í samræmi við niðurstöður Pilnik og Orange.61, sem benti á að notkun ensíma í ávaxtavinnslu geti aukið safaframleiðslu, bætt síun og fengið hágæða, tæran safa til þykkingar. Aukningin í safaframleiðslu er aðallega vegna aukins innihalds leysanlegs sykurs í safanum. Við ensímhýdroxý ávaxta eyðileggst mesóglea og pektín í frumuveggjum vörunnar og umbreytt í leysanleg efni eins og hlutlausan sykur og sýrur.62.pH-gildi ensímmeðhöndlaðs eplasafa var marktækt lægra en hjá samanburðarhópnum (P < 0,05) og pH-gildi beggja hópa jókst marktækt við geymslu (Tafla 1). Þessar niðurstöður eru í samræmi við niðurstöður Mark o.fl.63, sem benti á að pH gildi kasjúhnetusafa lækkaði eftir geymslu eftir hitameðferð. Niðurbrot pektíns og myndun galaktúrónsýru eftir ensímmeðhöndlun gæti verið ástæða hækkunar á pH gildi við geymslu. pH gildi ensímmeðhöndlaðra sýna hélst á milli 4,05 og 4,31 meðan á geymslu stóð, en pH ómeðhöndlaðs eplasafa var á bilinu 4,12 og 4,33.
Heildarsýrustig (TA) bæði ómeðhöndlaðra og lakkasa-meðhöndlaðra sýna sýndi lækkandi þróun með auknum geymslutíma (Tafla 1). Lækkun sýrustigs var rakin til umbreytingar lífrænna sýra í kolvetni eða ensímhvarfa, sem og oxunar við geymslu safans.64Heildarsýrustig eplasafans og ensímmeðhöndluðu sýnanna var lægra en í öðrum djúsum (jarðarberjasafi 0,9%, plómusafi 2,2%, kumquat-safi 1,0%, apríkósusafi 2,4%, appelsínusafi 0,8%), en svipað og í öðrum djúsum (t.d. perusafi 0,3%).62Þessi munur á ómeðhöndluðum nýkreistum eplasafa getur stafað af ýmsum þáttum eins og ræktunarskilyrðum, erfðafræðilegum þáttum, þroskastigi og vinnsluaðferðum.65Minnkun á heildarsýrustigi eplasafa í samanburðarhópnum og lakkasa-meðhöndluðum hópi er í samræmi við niðurstöður Singh o.fl.66varðandi lækkun á heildarsýrustigi Jin Nuo eplasafa eftir 74 daga geymslu. Hins vegar, Oshmiansky og Wojdylo67fundu engar marktækar breytingar á sýrustigi eplasafa þegar áhrif hefðbundinna hreinsunaraðferða voru rannsökuð.
Niðurstöðurnar sem kynntar eru í töflu 1 benda til þess að heildaruppleysanlegt þurrefni (TSS) gildið í lakkasa-meðhöndluðum eplasafa var hærra en í ómeðhöndluðu sýninu. Þessar niðurstöður eru í samræmi við birtar rannsóknir.. 68Ennfremur sýnir Tafla 1 að TSS gildi samanburðarhópsins með eplasafa var 9,58 við upphafstíma og náði 11,05 við lok geymslutímabilsins. Þessi gildi eru lægri en TSS gildi fersks eplasafa sem Hamid o.fl. greindu frá.. 69(11,2 og 11,80, talið í sömu röð). TSS gildi eplasafasýnanna sem fengu lakkasa jókst verulega, byrjaði úr 11,23 og náði 12,93 eftir tveggja vikna geymslu við 4°C (Tafla 1). Svipuð aukning á TSS við geymslu sást einnig í sítrusávöxtum, sítrónum og sætum appelsínum. Aukning á heildar leysanlegu föstu efni (TSS) við geymslu gæti stafað af vatnsrof fjölsykra (sterkju) í einsykrur (sykur), aukningu á styrk vegna ofþornunar safans og niðurbroti pektíns í safanum í leysanlegt föst efni. Aukning á heildar leysanlegu föstu efni (TSS) er líklega vegna aukningar á leysanlegum sykri, sem getur myndast við umbreytingu pektíns eða sellulósa í leysanlegan sykur með pektíni eða sellulósa, talið í sömu röð, eða við vatnsrof sterkju í sykur, eins og Hamed o.fl. greindu frá.69.Áhrif lakkasa á eiginleika eplasafa má sjá sjónrænt, þar sem eplasafi með lakkasa sýnir betri flæði og minni seigju en ómeðhöndlaður safi. Þessi athugun er skráð í töflu 1; Seigja ensímmeðhöndlaðs sýnis var 1,87 cP, en seigja samanburðarsýnisins var 2,95 cP. Þessi marktæka lækkun á seigju er líklega vegna meiri vatnsbindingargetu pektínlíkra efna og myndunar samloðandi netbyggingar.
Í þessari rannsókn voru áhrif lakkasa á brúnunarstuðul (BI) eplasafa rannsökuð með því að mæla gleypni við 420 nm með litrófsmæli. Niðurstöðurnar eru sýndar í töflu 1. Við geymslu sýndi BI eplasafasýna, bæði í meðhöndluðum og ómeðhöndluðum hópum, smám saman hækkandi tilhneigingu. BI endurspeglar brúnunarstig og getur þjónað sem...mikilvægtvísbending um ensímvirk og óensímvirk brúnunarviðbrögð. Gleypni jókst marktækt við geymslu (P < 0,05). Í lok geymslu varA420Gildi eplasafasýna í samanburðarhópnum og ensímmeðhöndluðum hópum jókst um 217% og 121%, talið í sömu röð (Tafla 1). Niðurstöðurnar benda til þess að ensímmeðhöndlun geti á áhrifaríkan hátt dregið úr brúnun um um 56%. Niðurstöður Bezerra o.fl.[19]] eru í samræmi við niðurstöður okkar; Þeir notuðu lakkasa-glútaraldehýð-kókostrefjar til að skýra eplasafa og minnkaði þannig upprunalegan lit hans um 61%.
Þó að pólýfenól í ávaxtasöfum hafi jákvæð næringar- og lækningaleg áhrif á mannslíkamann, geta þau einnig brugðist við próteinum, valdið skýjun, botnfellingum eða gruggi í safanum, sem breytir bragði og ilm vörunnar og styttir geymsluþol hennar.71Markmið þessarar rannsóknar var að draga úr fenólinnihaldi eplasafa á öruggan hátt með því að nota lakkasa úr Pleurotus ostreatus NRC 620. Niðurstöðurnar sem kynntar eru í töflu 1 sýna að heildarinnihald fenólsambanda í lakkasa-meðhöndluðum eplasafa minnkaði verulega fyrir geymslu við 4°C. Ennfremur minnkaði heildarinnihald fenólsambanda einnig við geymslu í báðum sýnunum sem rannsökuð voru (Tafla 1). Rannsókn Sandri o.fl.72sýndi að ensímmeðhöndlaður eplasafi getur viðhaldið andoxunarvirkni sinni og innihaldi fenólsambanda. Niðurstöður rannsóknar Lettera o.fl.73sýna að meðhöndlun appelsínusafa með sveppalakkasa getur dregið úr innihaldi fenólsambanda í honum um allt að 45%.
Fenólsambönd hafa reynst hafa eiginleika eins og að binda sindurefna, draga úr og slökkva á súrefnismyndun, flytja vetnisatóm og gefa rafeinda til sindurefna, sem gerir þau að öflugum andoxunarefnum.74Þess vegna voru í þessari rannsókn aðferðir byggðar á DPPH og FRAP notaðar til að meta áhrif lakkasa á andoxunarvirkni eplasafa sem geymdur var í kæli í 14 daga (Tafla 2). Báðar aðferðirnar sýndu fram á aukningu á andoxunarvirkni við geymslu, sem gæti stafað af aukningu á fríum fenólsamböndum eða myndun Maillard-viðbragðsafurða (MRP), þar sem Maillard-viðbragðsafurðir eru líklega orsök aukningar á andoxunarvirkni.75Brúnunarviðbrögð sem ekki eru ensímtengd (þar á meðal niðurbrot askorbínsýru, Maillard-viðbrögð og sýruhvatað niðurbrot sykra) framleiða brún litarefni (melanoídín). Milliefni niðurbrotsafurða askorbínsýru og niðurbrotsafurða sykurs (eins og karbónýlsambönd) geta brugðist við amínósýrum í gegnum Maillard-viðbrögð.76Þótt brúnun ávaxta og grænmetis við geymslu hafi verið rannsökuð ítarlega, er skilningur okkar á þessum viðbrögðum enn takmarkaður.77Í samanburði við FRAP aðferðina sýndi eplasafi meðhöndlaður með lakkasa marktækt minni andoxunarvirkni með DPPH aðferðinni (Tafla 2) og andoxunarvirkni allra sýna jókst marktækt með auknum geymslutíma. Tvær mismunandi aðferðir til að ákvarða andoxunarvirkni voru notaðar í þessari rannsókn vegna þess að meginreglur þeirra eru ólíkar. DPPH aðferðin mælir getu til að hlutleysa sindurefni, en FRAP aðferðin mælir getu til að draga úr járnjónum. Því er mælt með því að nota margar aðferðir til að ákvarða andoxunarvirkni til að skilja betur andoxunarvirkni sýnanna sem rannsökuð voru.78
Ein af lykilniðurstöðum þessarar rannsóknar er að *Pleurotus ostreatus* lakkasi NRC 620 sýnir bestu virkni við 70°C og pH 3,0. Í samanburði við önnur sveppalakkasa sem almennt eru notuð til að hreinsa safa, eins og *Trametes versicolor* og *Ganoderma lucidum* lakkasa, sýnir *P. ostreatus* NRC 620 meiri hitastöðugleika og súrara pH. Lakkasa úr *Trametes versicolor* og *Ganoderma lucidum* sýna yfirleitt bestu virkni á bilinu 50-60°C og við pH gildi á milli 3,5 og 5,0. Þessi munur gæti stuðlað að bættri skilvirkni safahreinsunar, sérstaklega fyrir súra safa þar sem stöðugleiki við lægra pH gildi er mikilvægur. Einstakur eiginleiki *P. Í samanburði við önnur rannsökuð sveppalakkasa sýnir *Pleurotus ostreatus* NRC 620 getu til að virka á áhrifaríkan hátt við krefjandi aðstæður. Hærra kjörhitastig þess bendir til hugsanlegra kosta í iðnaðarnotkun, svo sem hraðari viðbragðshraða og minni örverumengun. Lágt sýrustig þess, sem hentar vel súru eðli margra safa, gæti verið gagnlegt í safahreinsunarferlum. Þessar niðurstöður réttlæta frekari rannsóknir á stórum stíl notkunar, sem gerir *Pleurotus ostreatus* NRC 620 að raunhæfum valkosti við hefðbundnar sveppalakkasagjafa. Í samanburði við fyrri rannsóknir komumst við að því að kjörhitastigið er 60°C og kjörsýrustigið er 3,0. Eftir viðbrögð við 60°C í 80 mínútur hélt *Ganoderma lucidum* lakkasi eftir.46% af virkni þess.79 Samkvæmt Kurniawati og Nicelle80, Ensím í *Ganoderma lucidum* sýna framúrskarandi til miðlungsgóða stöðugleika við 25°C og pH-gildi á bilinu 5,0 til 8,0, og stöðugleika við pH 6,0 og hitastig á bilinu 10 til 30°C. Í þessari rannsókn komumst við að því að kjörpasta pH og hitastig fyrir ensímvirkni *Pleurotus ostreatus* voru 3,0 og 70°C, talið í sömu röð. Eftir ræktun við 40°C og 50°C í tvær klukkustundir hélt ensímið 68,33% og 59,61% af virkni sinni, talið í sömu röð. Ennfremur sýndi Pleurotus ostreatus NRC 620 lakkasi mikla virkni yfir breitt hitastigsbil frá 50°C til 80°C og náði næstum hámarksvirkni (69%–98%), þar sem hámarksvirkni sást við 70°C.
Að lokum sýndi ostrusveppalakkasa NRC620, sem fékkst við kyrrstæðar aðstæður, bestu virkni og stöðugleika við mismunandi pH- og hitastigsskilyrði, sem sýnir betri stöðugleika samanborið við aðrar ensímgjafa. Viðbót 10 mM MgSO₄ og CuSO₄ jók ensímvirkni um það bil 21% og 35%, talið í sömu röð. Þegar ensímið var unnið í eplasafa lækkaði það pH og seigju, en fenólinnihaldið minnkaði aðeins lítillega við geymslu.
Niðurstöðurnar staðfesta möguleika lakkasa í matvælaiðnaði, sérstaklega við hreinsun drykkja. Með því að brjóta niður fenólsambönd sérstaklega dregur lakkasa ekki aðeins úr gruggi og bætir tærleika heldur viðheldur það einnig gæðum ávaxtasafa við vægar rekstraraðstæður. Ólíkt hefðbundnum hreinsunarefnum eins og gelatíni, bentóníti og kísilgeli myndar lakkasa ekki úrgang eða fjarlægir þægilega ilm úr drykkjum, sem gerir það að umhverfisvænni og sjálfbærari valkosti. Ennfremur, samanborið við önnur ensím og síunaraðferðir, býður lakkasa upp á markvissa og hagkvæma lausn án þess að skerða gæði vörunnar.
Kyomuhimbo, HD og Brink, HG. Notkun og aðferðir til að stöðva kopar-innihaldandi lakkasa; yfirlit. Heliyon 9, e13156 (2023).
Birtingartími: 15. des. 2025